2.2.2碱溶液浓度和水解时间的液相幼儿选择
以NIST 1849a配方乳粉质控样作为研究对象，使用2、色谱食品3和4 mol/L 3种浓度的内标LiOH溶液分别水解18、20和22 h，法测测定的定婴色氨酸含量如图4所示。由图中数据可知，配方2和3 mol/L碱溶液经22 h仍没有水解完全，中色而4 mol/L的氨酸LiOH在18 h已经水解完全，继续水解20和22 h没有明显变化，含量为了保证充分的液相幼儿水解，以准确测定总色氨酸的色谱食品含量，选择4 mol/L LiOH水解溶液、内标水解时间20 h作为最佳的法测水解条件
2.2.3水解温度的确定
为考察水解温度的影响，设计了100、定婴110、配方120 ℃ 3个水解温度进行考察，结果见图5。由图中数据可见，110和120 ℃水解结果在18和20 h的时候无显著差异，但120 ℃在22 h以后出现了明显的下降；而在100 ℃条件下，样品水解至22 h依然未能水解完全，且增加反应时间后，色氨酸浓度反而出现了下降，通过色氨酸标准品的碱水解实验验证，发现水解时间过长，游离色氨酸会部分被破坏，故本方法选择110 ℃作为水解温度。
2.2.4碱水解法内标确定
由于碱水解过程温度高，时间长，对不同的样品进行加标回收试验发现色氨酸长时间在高温高浓度的碱中会有一定程度的损失，而且不同基质中色氨酸的损失不同。试验增加了在碱水解过程中充氮保护的措施，结果表明色氨酸的损失在充入氮气保护后略有改善，但使用充氮保护下碱水解的方法测试质控样NIST1849a，结果仅为168 mg/100 g，不能达到满意的结果；参考标准GB/T 15400—2018 《饲料中色氨酸的测定》在水解前对样品进行除脂，试验结果表明除脂仅对水解液的外观有所改变，对测定结果没有改善。因此在优化前处理方法无法有效降低色氨酸损失的前提下，采用色氨酸的结构类似物作为内标进行同步校正，提高定量准确性的同时简化样品处理步骤。本方法将5-甲基-色氨酸和α-甲基-色氨酸作为研究对象来考察其作为内标物定量碱水解方法测定色氨酸含量的可行性。
先后选择了NIST质控样1849a和1869作为研究对象，分别加入5-甲基-色氨酸和α-甲基-色氨酸内标后，进行碱水解。表2不同定量方式和不同内标的定量结果显示，相同条件下以α-甲基-色氨酸作为内标得到的2个质控样的含量均能满足明示的范围，而5-甲基-色氨酸作为内标得到的结果偏高，外标法定量的结果则达不到质控样的明示下限。以α-甲基-色氨酸作为内标来定量能得到更为准确的结果。
2.3方法学验证
2.3.1线性范围和定量限
准确吸取色氨酸标准溶液（100 μg/mL）20、100和500 µL、1.0、2.0和5.0 mL于10 mL容量瓶中，加入100 µL内标（1 mg/mL）工作液，用水定容至刻度，混匀后得到浓度分别为0.2、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的标准工作溶液，分别将标准系列工作液按照浓度由低到高的顺序注入液相色谱仪中，测得相应色谱峰的峰面积，以系列混合标准工作液的浓度为横坐标，以目标化合物的峰面积与内标的峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线。相关系数r＞0.999，覆盖方法定量限和常见样品的含量水平，线性良好。将S/N＞10且能准确定量的最低浓度点计算出的含量确定为方法的定量限。结果见表3。
2.3.2方法准确度和精密度
试验选取代表性样品进行加标回收试验，样品分别为婴幼儿配方乳粉、乳蛋白部分水解样品和氨基酸配方样品，对样品进行平行试验得出本底值后再对每个样品做0.5倍、1倍和2倍本底值水平的加标试验，以回收率和相对标准偏差（RSD）评价方法的准确度和精密度。试验样品回收率和RSD见表4。样品的平均回收率在92.5%~97.4%之间，RSD差均小于3.11%。将试验样品选取4家机构进行验证，实验室间RSD小于6.7%，显示了良好的准确度和精密度。
2.3.3实际样品应用
采用开发的方法对21个不同种类样品进行测定。样品包括不同品牌婴幼儿配方乳粉8个、乳蛋白部分水解配方食品4个、乳蛋白深度水解配方食品4和氨基酸配方食品5个。样品中色氨酸含量范围为170~315 mg/100 g，回收率92%~98%，均符合GB 10765—2010《食品安全国家标准婴儿配方食品》中对色氨酸含量的要求。
3.结论
本研究以α-甲基-色氨酸为内标物，采用碱水解-高效液相色谱法测定了乳粉及特殊医学用途婴儿配方食品中的色氨酸。内标法较好的校正了水解过程中高温、高浓度碱溶液和不同基质在处理过程中对色氨酸的影响，同时省略了前处理过程中充氮气保护等步骤，对该方法进行方法学验证，也能得满意的准确度和精密度。应用于不同种类的样品和质控样中目标物的测定均符合明示值，表明该方法操作简单、准确度高，重复性好，适用于乳粉及特殊医学用途婴儿配方食品中色氨酸的准确定性定量，可为企业生产和有关部门监管提供理论支撑。
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